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河南快320190531076:微生物基因組測序

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微生物基因組從頭測序
產品介紹
簡介:



微生物廣泛存在于自然界中,與人類的生產和生活息息相關。微生物生物多樣性豐富,基因組具有相對較小、重復序列較高、易于突變等特點,因此很必要對微生物進行全基因組測序,而且同動植物相比較在時間和成本上也容易實現。目前,全基因組測序成為微生物遺傳進化、疾病預防控制、生物工程技術等方面重要的研究和開發手段。

一、技術路線
 Illumina MiSeq

二、生物信息分析

1. 原始數據整理、過濾及質量評估

2. Survey 分析 (基因組大小估計)

3. 基因組拼裝與分析:
♦序列拼裝
♦ 拼裝統計(N20、N50、N90、總拼接長度、最長拼接長度、GC含量、總序列數量、>1 kb序列數量、N數量、N比例、測序深度等)
♦測序深度分布圖
♦基因組圈圖繪制(僅適用于完成圖)

4. 功能元件分析

5. 蛋白編碼基因功能注釋:
♦序列比對 (數據庫:refseq)
♦GO注釋 (數據庫:refseq)
♦COG注釋 (數據庫:eggNOG)
♦KEGG注釋(KAAS,BBH)

比較基因組學分析:
♦基因家族分析(共有基因,特有基因分析)
♦共線性
♦基于 16s rDNA或 18s rDNA的進化分析

三、結果展示


 

 
四、樣品要求
1、細菌:Miseq DNA PE文庫濃度≥20 ng/ μl,總量≥6 μg(熒光定量);Miseq DNA MP文庫濃度≥40 ng/ μl,總量≥12 μg(熒光定量);454 DNA庫濃度≥20 ng/ μl,總量≥3 μg(熒光定量)。電泳檢測無明顯RNA條帶,基因組條帶清晰、完整,主帶應在100 kb以上,DNA無降解,無污染提供菌粉>1 g,菌液>5 ml,盡量提供較多量,不同的物種DNA提取產量有差異。

2、真菌:Miseq DNA PE 文庫濃度≥20 ng/ μl,總量≥6 μg(熒光定量);Miseq DNA MP 文庫濃度≥40 ng/ μl,總量≥12 μg(熒光定量);454 DNA庫濃度≥20 ng/ μl,總量≥3 μg(熒光定量)。提供組織樣品應>1 g,盡量提供較多量,不同的物種DNA提取產量有差異。

3、樣品保存期間切忌反復凍融。 

4、送樣管務必標清樣品編號,管口使用Parafilm 膜密封。

5、提供DNA電泳檢測照片,用自封袋密封后隨樣品一起送樣。

五、華津優勢

1.平臺優勢:擁有ABI 3730 XL、Roche 454 FLX+、Illumina Miseq和Illumina HiSeq2000高通量測序平臺,多種平臺聯合應用,優勢互補,滿足客戶不同需求。

2.技術團隊:擁有經驗豐富的技術人員,專業的生物信息團隊和大型計算機服務系統,可提供個性化生物信息分析服務。

3.項目周期:個人型測序平臺,無需長時間湊樣上機,極大縮短項目周期。

4.免費服務:免費方案設計、免費標準分析、免費論文潤色。

經典案例一
海豚鏈球菌全基因組測序
 

背景:海豚鏈球菌是革蘭氏陽性致病菌,不僅能夠感染淡水、咸水魚類,而且能夠感染人類,被認為是對水產養殖業發展影響最大的致病菌之一。

目的:運用Roche 454 FLX+、Illumina MiSeq平臺對海豚鏈球菌SF1進行全基因組測序,從而對海豚鏈球菌SF1的蛋白編碼基因,信號通路轉導,碳水化合物代謝,以及如何對抗宿主免疫應答反應等進行研究分析,了解其致病機制。
 

結果:海豚鏈球菌SF1的全基因組大小為2.15 Mb,GC%含量為36.7%,共注釋到2125個蛋白質編碼基因,預測到45 tRNA基因和12 rRNA基因。CRISPR/Cas系統是目前發現存在于大多數細菌與所有的古菌中的一種后天免疫系統,以消滅外來的質體或者噬菌體,并在自身基因組中留下外來基因片段作為“記憶”,本研究在SF1中發現一個CRISPR位點和4個Cas基因。通過進一步的蛋白質組學實驗檢測到SF1中21個被宿主血清誘導表達的分泌蛋白,為了進一步驗證這些蛋白的功能,經過免疫效果實驗顯示其中的兩個候選蛋白可以作為制備防治該種魚病的疫苗使用。本研究結果為其他類型的海豚鏈球菌的研究提供了一個分子生物學理論基礎,尤其是在對海豚鏈球菌的發病機制和對水產品疾病控制方面具有重要意義。

原文索引:[Zhang B C, et al. Streptococcus iniae SF1: complete genome sequence, proteomic profile, and immunoprotective antigens[J]. PloS one, 2014, 9(3): e91324.]

經典案例二
條石鯛虹彩病毒全基因組測序
 

背景:虹彩病毒科是雙鏈DNA病毒,包括5個病毒屬,其中細胞腫大病毒屬病毒可導致許多種水產養殖魚類致病,因此對水產養殖業造成很大的威脅。

目的: RBIV-C1是從條石鯛中分離出來的虹彩病毒細胞腫大病毒屬,通過對RBIV-C1病毒進行全基因組測序,全面掌握該病毒的全基因組信息,從而了解其基因表達模式,同時通過與其他已有基因組序列信息的虹彩病毒進行比對,探究其變異來源,并尋找RBIV-C1的特異性,為RBIV-C1病毒菌株的的鑒定尋找新的方法和依據,為魚病的防治工作尋找新的思路。


 
 

結果:條石鯛虹彩病毒RBIV-C1的全基因組大小為112.3 kb,GC%含量為55%。同時發現RBIV-C1中有4584個簡單重復序列,其中89.8%的簡單重復序列分布在編碼區,并預測到119個開放閱讀框。另外與OSGIV和RBIV進行序列比對發現,它們的序列相似度達到99%,推測可能是同一病毒菌株的變異,在RBIV-C1基因組中發現了11個插入突變,13個缺失,103個SNP位點,這些變異位點可成為RBIV-C1鑒定的依據。通過進一步的qPCR全基因轉錄模式分析,顯示119個開放閱讀中有118個在活體感染時表達,并根據它們的表達模式,將其分為3個系統聚類,這一結果為細胞腫大病毒屬的基因性能和基因表達特性的研究提供了新的參考。 

原文索引:[ Zhang B C, et al. Complete genome sequence and transcription profiles of the rock bream iridovirus RBIV-C1. Dis Aquat Org, 2013, 104: 203-214.]

常見問題
1.Q:微生物基因組測序的技術指標是什么?

A微生物基因組測序按測序精度大致可以分為框架圖、精細圖和完成圖三類??蚣芡家蠡蜃楦哺嵌卻笥?5%,基因區覆蓋度達到98%以上,單堿基錯誤率低于十萬分之一;精細圖要求基因組覆蓋度大于98%,基因區覆蓋度達到99%以上,單堿基錯誤率低于十萬分之一,gap數不超過100個;完成圖要求完整基因組序列,單堿基錯誤率低于十萬分之一,gap數不超過5個。

2.Q:什么是測序深度和覆蓋度?

A:測序深度是指測序得到的總堿基數與待測基因組大小的比值。假設一個基因大小為2M,測序深度為10X,那么獲得的總數據量為20M。覆蓋度是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復序列等復雜結構的存在,測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區域,這部分沒有獲得的區域就稱為Gap。例如一個細菌基因組測序,覆蓋度是98%,那么還有2%的序列區域是沒有通過測序獲得的。

3.Q:如何使GC含量過高或過低物種的基因組測序達到相應組裝標準?

A當GC含量大于65%或小于35%時測序難度均會增加,需要構建不同長度測序文庫,并通過加大測序量才能夠達到組裝標準。

4.Q:如何完成基因組中重復序列數據的準確拼接?

A通過構建不同長度測序文庫并使用Roche 454 FLX+平臺深度測序,可以對重復序列引起的錯誤進行校正。