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官方认证河南快3投注技巧:siRNA合成

河南快3和值遗漏分析 www.yflkx.com siRNA 套餐

 

為了回饋廣大客戶對本公司的鼎力支持,特推出 RNAi 系列優惠套餐,供廣大新老客戶選擇。

有效性承諾

 

客戶只需提供基因序列 GeneID 或者 Accession number, 我們免費幫您設計選擇合適的位點,

siRNA oligo 細胞轉染效率達到 70%以上,我們可以保證至少有一對可以有效的抑制相應基因

(mRNA)的表達,抑制效率可達 70%以上.

 

產品描述

目錄號

產品名稱

規格

純化方式

交貨期限

A10001

普通 siRNA 經濟型套餐-A

1

HPLC

6 個工作日

A10002

普通 siRNA 實惠型套餐-B

1

HPLC

6 個工作日

A10003

化學修飾 siRNA 經濟型套餐-C

1

HPLC

6 個工作日

A10004

化學修飾 siRNA 實惠型套餐-D

1

HPLC

6 個工作日

A10005

熒光修飾 siRNA 經濟型套餐-E

1

HPLC

6 個工作日

A10006

熒光修飾 siRNA 實惠型套餐-F

1

HPLC

6 個工作日

 

普通 siRNA 經濟型套餐 A

套餐內容

規格

純化方式

目的基因 siRNA oligos

3 對(3×2 OD)

HPLC

陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

FAM 標記陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

陽性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC


普通 siRNA 實惠套餐 B

套餐內容

規格

純化方式

目的基因 siRNA oligos

4 對(4×4 OD)

HPLC

陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

FAM 標記陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

陽性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

 

化學修飾 siRNA 經濟套餐 C

套餐內容

規格

純化方式

目的基因 siRNA oligos

3 對(3×2 OD)

HPLC

陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

FAM 標記陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

陽性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

 

化學修飾 siRNA 實惠套餐 D

套餐內容

規格

純化方式

目的基因 siRNA oligos

4 對(4×4 OD)

HPLC

陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

FAM 標記陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

陽性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

 

熒光修飾 siRNA 經濟套餐 E

套餐內容

規格

純化方式

目的基因 siRNA oligos

3 對(3×2 OD)

HPLC

陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

FAM 標記陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

陽性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

 

熒光修飾 siRNA 實惠套餐 F

套餐內容

規格

純化方式

目的基因 siRNA oligos

4 對(4×4 OD)

HPLC

陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

FAM 標記陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

陽性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

 

in vivo 化學修飾 siRNA 經濟套餐 G(全鏈甲氧修飾,末端膽固醇修飾)

套餐內容

規格

純化方式

目的基因 siRNA oligos

3 對(3×2 OD)

HPLC

陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

FAM 標記陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

陽性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

 

in vivo 化學修飾 siRNA 實惠套餐 H(全鏈甲氧修飾,末端膽固醇修飾)

套餐內容

規格

純化方式

目的基因 siRNA oligos

4 對(4×4 OD)

HPLC

陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

FAM 標記陰性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

陽性對照 siRNA oligos

1 對(1×1 OD)

HPLC

 

實驗數據

 

siRNA Real-Time PCR 結果分析

 

對于 RNAi 實驗而言,我們通常需要知道的是某一特定細胞在導入 siRNA 前后某一特定基因的

表達變化情況來判斷 siRNA 起到了 Gene Knockdown 作用。應用熒光定量 PCR 的方法,可以

通過兩種途徑來實現上述判斷,一是測定特定細胞在導入 siRNA 前后某一特定基因 mRNA 數量

的變化,即為絕對定量;二是通過檢測特定基因與某一管家基因在在導入 siRNA 前后相對表達情況的變化,即為相對定量。通常采用相對定量的方法來檢測 siRNA 的 Gene Knockdown 作用。

 

1Real-Time PCR 實驗設計

 

Real-Time PCR 實驗設計時應包括實驗組(導入 siRNA),陰性對照(Negative Control)和 Mock Transfaction 三組。每組至少三個重復。各組同時檢測目標基因和管家基因的 Ct 值。下例中以 GAPDH 為管家基因。
 

 

2Real-Time PCR 得到 siRNA 導入前后目標基因和管家基因的 Ct

 

各組重復實驗的 Ct 值差異不能過大;一般地,重復實驗 Ct 值差異在 1 以內是可以接受的。
 


實驗組

 

陰性對照(NC)

Mock Transfection

Target Gene

GAPDH

Target Gene

GAPDH

Target Gene

GAPDH

30.40

23.63

24.21

22.66

26.21

24.60

30.35

23.40

24.60

22.56

26.15

24.31

30.41

23.52

24.66

22.48

26.35

24.72

 

3Real-Time PCR 數據分析

  1. Mock Tansfection 為對照(Calibrator),管家基因為 Normalizer,ΔΔCt=(Ct 目的基因-Ct

 

管家基因)實驗組-( Ct 目的基因- Ct 管家基因)對照

 

Target Gene

GAPDH

Ct

Ct

Target Gene

 

 

 

Target

Ct–  C

 

 

Average Ct

Average Ct

Gene–GAPD

 

Rel. to Mock

 

 

 

 

t, Mock

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

Moc

26.24±0.1

24.54±0.2

1.7±0.21

0.00±0.2

1.0(1.16-0.86)

k

0

1

 

1

 

 

 

 

 

 

 

30.39±0.0

23.51±0.1

6.88±0.17

5.18±0.1

 

 

 

 

 

 

 

9*1

5*2

*3

7

031)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NC

24.49±0.2

22.56±0.0

1.93±0.25

0.23±0.2

0.85(0.71-

 

4

9

 

5

1.01)

 

 

使用方法

 

AsiRNA 轉染的方法

哺乳動物轉染的常見方法有:磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和 polybrene、機械法(例如,顯微注射和基因槍)、陽離子脂質體試劑,其中陽離子脂質體試劑轉染法是目前最常用的轉染方法。

 

應用脂質體型轉染試劑進行轉染需要注重的幾個方面:轉染試劑的用量、siRNA 的用量、轉染時的細胞密度、轉染時的操作順序、細胞與轉染試劑/siRNA 復合物的溫浴的時間

 

BLipofectamin2000 轉染試劑

選擇最適合的轉染試劑和轉染條件,往往取決于不同的哺乳動物細胞類型和不同的核酸分子。

Lipofectamin2000 適用于核酸的體內和體外操作,可應用于 DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA

的轉染,也可應

用于 DNA/siRNA 的共轉染操作;是一種新型的高效 siRNA 轉染試劑。

 

Lipofectamin2000 的應用領域:

1、原代培養細胞和轉化細胞株的基因轉染

2、siRNA 高通量轉染試驗

3、DNA 轉染;DNA 和 siRNA 的共轉染

4、核酸(siRNA、DNA、RNA)的體內導入試驗

5、貼壁細胞和懸浮細胞轉染

 

Lipofectamin2000 的特點:

1、不必更換培養基,操作簡便易行,可在半小時內完成操作

2、在含血清培養基中也能表現高轉染效率

3、細胞毒性低;適用細胞廣泛

4、即用型試劑,可在含有抗生素的完全培養基中轉染

5、基于脂質的轉染試劑,確保沒有 RNAse 活性

6、可介導 siRNA 高轉染細胞及體內 siRNA 的高效導入

C. Lipofectamin2000 適用的細胞類型

Lipofectamin2000 轉染試劑可廣泛應用于多種細胞系的 DNA 和 siRNA 轉染如:HeLa(人頸部癌細胞)、MCF-7(人乳房癌細胞)、Hep3B(人肝細胞癌細胞)、COS-7(猴腎細胞)、Neuro-2a(鼠神經母細胞瘤細胞)、NIKS(人角質化細胞)、B16(鼠黑素瘤細胞)、DLD-1(人結腸癌細胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細胞)、HT-29(人結腸腺癌細胞)、A549(人肺癌細胞)、CHO-k1(倉鼠卵巢細胞)和293(腺病毒 5 DNA 轉化的人胚胎腎細胞),SVRbag4 細胞等。

 

D.轉染前細胞培養

在細胞板上培養細胞時,應使細胞匯合在 24 小時內達到 70-90%。

 

E.合適的 lipofectamin2000 用量

合適的 siRNA(DNA):lipofetamin2000 比例對核酸的高效轉染有重要影響;我們推薦的 DNA:

lipofetamin2000 為 1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000 為 1:0.01-1:0.1(pmol:

ul)一般情況下,此范圍內都可獲得高的轉染效率。

 

 

F.貼壁細胞轉染程序

選用生理狀態良好的細胞對提高轉染效率很重要。siRNA(DNA)和 lipofectamin 的用量和兩者的比例可在推薦范圍內適當調整。

 

1、轉染前一天,4-5´104 細胞接種在 24 孔板上,0.5mL 含 FBS 和抗生素的 DMEM(或 Opti-MEM,

其他培養基)細胞培養基。

2、選擇用于初期接種的細胞數量,應能在 24 小時內使細胞匯合達到 70-90%。

3、在 50μl 的 DMEM(或 Opti-MEM,或其他無血清培養基)無血清培養基加入 20pmol siRNA(或

0.8μg DNA),柔和混勻;

4、混勻 lipofectamin 試劑,用 50μl 無血清的 DMEM 或 Opti-MEM,或其他無血清培養基)稀

  1. 1μl lipofectamin 試劑(DNA 轉染時,則加入 2μllipofectamin 試劑),輕輕混勻,室溫放置 5

 

分鐘;

5、將稀釋好的 siRNA  和 RNAi-Mate  試劑混合;輕柔混勻,室溫放置 20  分鐘,以便形成

siRNA/lipofectamin(或 DNA/lipofectamin)復合物。

6、將 100μl siRNA/lipofectamin(或 DNA/lipofectamin)復合物加到含有細胞和培養基的培養板

的孔中,來回輕柔搖晃細胞培養板板。

7、 細胞在 CO2 培養箱中 37℃溫育 24h-48h 后,進行轉染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感,孵育 4-6 小時后,除去復合物,更換培養基。

G.懸浮細胞轉染程序

1、轉染的當天,收集細胞離心,用含 FBS 的培養基重懸。

2、在 50μl 的 DMEM(或 Opti-MEM,或其他無血清培養基)無血清的培養基加入 20pmol siRNA(或

0.8μg DNA),柔和混勻;

3、混勻 lipofectamin 試劑,用 50μl 無血清的 DMEM 或 Opti-MEM,或其他無血清培養基)稀

  1. 1μl lipofectamin 試劑(DNA 轉染時,則加入 2μl lipofectamin 試劑),輕輕混勻,室溫放置 5

 

分鐘;

4、將稀釋好的 siRNA  和 lipofectamin  試劑混合;輕柔混勻,室溫放置 20  分鐘,以便形成

siRNA/lipofectamin(或 DNA/lipofectamin)復合物。

5、再加入 400μL 細胞懸浮液(細胞數量決定于細胞類型和轉染后分析測試的時間)。

6、細胞在 CO2 培養箱中 37℃溫育 24h-48h 后,進行轉染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感,孵育 4-6 小時后,除去復合物,更換培養基。

 

 

HDNA  siRNA 共轉染細胞

1、在轉染的前一天,4-5´104 細胞接種在 24 孔板上,0.5 mL 含 FBS 和抗生素的細胞培養基。

2、選擇用于初期接種的細胞密度,應能在 24 小時內使細胞匯合達到 70-90%。

3、在 100μL 的無血清的培養基中稀釋 20pmol siRNA 和 0.2μg DNA,加入 2μl lipofectamin 試劑,充分混合,放置 20 分鐘,以便形成 siRNA/ DNA/lipofectamin 復合物。

4、將 siRNA/ DNA/lipofectamin 復合物加入培養基中,輕輕混勻。

5、細胞在 37℃溫育 24h-48h 后,進行轉染后的其它步驟。

 

IsiRNA 體內導入方法

1、適量的 siRNA 或 DNA 溶于不含 RNA 酶的無菌水中,輕輕混勻,因為注射液體積有限,建議采用高濃度的 siRNA 或 DNA,一般 DNA 為 2μg /μL、siRNA 為 10μg /μL。

2、取適量的 DNA、siRNA 或 siRNA\DNA 復合物與 lipofectamin 混合。例如,在 1#管中加入

0.5μL 的 DNA(1μg)和 0.5μL 的 siRNA(5μg),在 2#管中加入 0.55μL 的 lipofectamin(24μg)

  1. 0.45μL 不含 RNA 酶的無菌水中,將 1#管中的溶液加入 2#管中,在室溫下溫育 30 分鐘,以形成 siRNA/DNA-lipofectamin 復合物。

 

3、制備的 siRNA/DNA-lipofectamine 復合物可用于體內導入 siRNA、DNA 或 siRNA\DNA。